A l’œil nu, une bactérie n’est pas visible. Au microscope, elles ne sont pas identifiables très précisément d’un point de vue taxonomique (classement des êtres vivants selon leur règne, embranchement, classe, ordre, famille, genre et enfin espèce). Pour pouvoir les étudier et les identifier il faut réaliser toute une série de tests et observations.

Pour cela, on a besoin de " cultiver " les bactéries, de les faire croître dans des conditions optimales. On adapte le milieu de culture, où vont se développer la ou les bactéries. On ajuste ensuite le conditionnement de ce milieu. Il ne faut pas non plus incorporer les bactéries de n’importe quelle façon selon l’objectif de la manipulation. Enfin toutes ne se développent pas à la même vitesse. On adaptera le temps d’incubation en étuve.

A partir de cela, on pourra réaliser des tests sur les bactéries elles-mêmes que l’on aura prélevées dans les milieux de culture.

La croissance en gélose, milieu solide, donne lieu à l’apparition d’amas de bactéries que l’on appelle des colonies. Une bactérie donne une colonie. Il peut cependant avoir confusion si deux germes poussent l’un à coté de l’autre et se rejoignent. Avec de l’expérience, on arrive à distinguer si on a une colonie ou un amas de colonies. On peut ainsi compter les colonies et en déduire le nombre de bactéries qui étaient présentes dans le volume incorporé au milieu.

On appelle milieu de culture, le support qui peut être liquide ou solide, dans ou sur lequel on apporte les bactéries pour permettre leur développement puis leur identification.
A l’inverse de la majorité du règne animal ou végétal, on ne peut pas identifier précisément une bactérie à sa morphologie. Cette identification est donc grandement réalisée par les tests biochimiques.
On cherche à mettre en avant des caractères propres à chaque germe.

Le milieu de culture a différentes finalités.

• Les milieux de base. Ils ont pour but de permettre la croissante d’un maximum de germes. Il n’existe pas de milieu universel du fait même de l’exigence de certaines bactéries concernant les nutriments. On choisit donc son milieu en fonction des populations que l’on veut mettre en avant. En analyse de l’eau, on choisit une simple gélose nutritive. Elle est à base d’extrait de viande pour la nutrition des bactéries.

• Les milieux d’isolement. Ils permettent la croissance de certaines bactéries que l’on veut plus spécifiquement observées.

On peut avoir des milieux dits
de base, ils n’ont pas de caractéristiques précises mais le développement bactérien à lieu. On peut les utiliser si le milieu est peu chargé.
enrichis en substance nutritive pour doper la croissance de germes difficiles à obtenir. La gélose cœur-cervelle permet d’obtenir la croissance des spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices.
d’identification. Ce sont les milieux les plus nombreux. Ils assurent la croissance d’un type bactérien tout en inhibant ou ralentissement la croissances des autres. La composition en est la principale cause. Jouent aussi la température et le temps d’incubation. Ils peuvent aussi conférer une couleur aux colonies qui permet de les identifier.
de conservation. Ils sont pauvres en nutriments et servent juste à maintenir les souches en vie ralentie pour les réutiliser ultérieurement et préserver la collection. On ne peut pas laisser à vitam eternam, il faut le changer de temps à autre pour que les bactéries survivent. On régule également la croissance par la température de stockage.

Ils peuvent être sous forme de gélose : on a la consistance de la gelée alimentaire ; ou sous forme de bouillon, c’est à dire liquide.
La gélose donne lieu à des colonies en cas de croissance bactérienne et éventuellement un halo de coloration/décoloration en périphérie de la colonie. Dans le cas d’un bouillon, on a modification de l’aspect du milieu. Cette modification peut être due à un trouble ou un changement de couleur en raison de la prolifération bactérienne.

Les milieux de culture ne sont pas tous conditionnés de la même manière.
Selon l’utilisation que l’on veut en faire, la présentation sera différente. Les deux modes d’utilisation sont en tube ou en boite de Pétri.

On a un tube fermé stérilement qui renferme le milieu de culture. Celui-ci peut être liquide ou gélosé. On utilise ce conditionnement pour une très grande majorité de tests. Prenons par exemple le test de mobilité en milieu Mannitol-mobilité. On réalise l’ensemencement par piqûre centrale. Le milieu est orange. S’il y a développement bactérien, on a un virage au jaune (du à l’acidification du milieu). Si la bactérie n’est pas mobile, seule la piqûre centrale jaunit ; sinon, une plus ou moins grande partie de la gélose est décolorée. On parle de culot car la gélose est simplement coulée dans le tube puis refroidie. Les bouillons sont conditionnés uniquement en tube.

Ces tubes sont utilisés pour déterminer le type respiratoire des bactéries. L’étroitesse permet de plus facilement contrôler la quantité d’oxygène présente tout au long du tube. En surface, l’oxygénation de la gélose est optimale et plus on descend, plus il se raréfie. Grâce à un trouble ou une décoloration du milieu, on peut déterminer si la bactérie est

Aérobie : elle a besoin d’oxygène ;
Anaérobie facultative : elle a besoin d’oxygène mais tolère les milieux anaérobie ;
Anaérobie aérotolérente : elle se développe quelle que soit la quantité d’oxygène. Elle adapte sa respiration ;
Anaérobie stricte : elle ne supporte par l’oxygène ;
Microaérophile : elle supporte l’oxygène en faible quantité mais en a un besoin vital.

Il s’agit d’une gélose que l’on coule puis que l’on solidifie en pente. Cela a pour but d’observer un développement en surface, en présence d’oxygène. On peut ainsi ce rendre compte de l’aspect des colonies, mais on ne cherche pas à les dénombrer ou à les identifier.

Ce système permet d’observer le développement, ou non, en aérobie et anaérobie et ainsi de comparer la voie d’attaque d’un élément en particulier. Par exemple, on ensemence une gélose en culot + pente pour voir si le germe dégrade une protéine définie. On observe un virage coloré du culot mais pas de la pente. On peut en déduire que la bactérie est capable de métaboliser cette protéine en anaérobiose mais pas en aérobiose.

Il s’agit d’une boite ronde et peu épaisse, de diamètre variable, dans laquelle on coule la gélose en fusion. Puis, on la referme et, après solidification, on incube selon les conditions du test.
Il s’agit du support pour les filtrations. Cette boite a vocation d’isolement et d’identification.

Selon le conditionnement, on utilisera différentes méthodes.

La conserve permet d’y placer les outils avant de les stériliser par autoclave. Elle contient de l’eau de Javel ou de l’alcool.
Attention, avant et après toute manipulation, il faut absolument stériliser les instruments en les portants au rouge dans la flamme du bec Bunsen

-- On plonge l’oëse dans la suspension bactérienne réalisée à partir d’une colonie ou plusieurs colonie que l’on veut identifier ou confirmer.
-- On la retire sans toucher les parois du tube. L’anneau contient une bulle de suspension avec des bactéries.
-- On plonge ensuite l’oëse dans le tube de bouillon. Et on l’agite sur toute la hauteur afin de répandre la suspension dans tout le milieu.
-- On referme le tube et on peut le placer en incubation.
On prendra garde à conserver tous les objets dans la zone stérile du bec Bunsen et de ne jamais les faire entrer en contact avec la paillasse.
Les embouts des tubes seront passés à la flamme avant et après toute manipulation, tout comme les instruments.

L’ensemencement se fait par piqûre centrale au fil droit après avoir préalablement chargé celui-ci de suspension.

Les tubes étroits sont ensemencés grâce à une pipette Pasteur. Une pipette Pasteur est une canne de verre, cotonnée aux deux extrémités, afin de maintenir l’extérieur stérile. On l’étire à la flamme du bec Bunsen pour l’affiner en son centre. On étire dans la flamme jusqu’à rupture. On sépare les deux parties.

Quand elle est réussie, elle est longue et assez fine pour atteindre le fond du tube. Il est préférable de la boutonner : créer une petite boule de verre à l’extrémité de l’étirement en la travaillant à la flamme

.

On ensemence de tube du fond vers la surface, en réalisant un mouvement hélicoïdal, la suspension bactérienne est libérée progressivement. La pipette est à usage unique et éliminée via la poubelle pour produits contaminés.

On utilise l’oëse chargée de suspension selon le procédé décrit pour le milieu liquide. On réalise des stries sur toute la longueur de la pente en commençant au fond du tube ; en remontant, il faut espacer les stries pour " étaler " la suspension.

Le culot est classiquement inoculé au fil droit et la pente à l’oëse selon le principe de la gélose inclinée.

Ce mode de culture observe plusieurs variantes de techniques d’ensemencement.
-- Par inondation. Quelques mL de suspension sont déposés à la surface de la gélose, on la recouvre totalement. L’excès est éliminé.
-- Par étalement. Utilisé en dénombrement, un volume précis de suspension (en général 100µL) est déposé à la surface de la gélose. La goutte d’inoculum est ensuite étalée au râteau ou avec des billes de verre stériles que l’on retire ensuite de la boite avant l’incubation.
-- Par la méthode des doubles couches. La gélose est inoculée par étalement puis on coule une deuxième couche de gélose en fusion par dessus la première. On crée ainsi une zone microaérobie.
-- Par incorporation dans la gélose. On incorpore une quantité connue de suspension à la gélose en fusion. Après homogénéisation, on coule en boite de Pétri et on laisse solidifier.
-- Par stries d’épuisement. On dépose l’inoculum au bord de la boite. A partir de là, on l’étale à l’aide d’une oëse selon la méthode des cadrans.

1. Faire un point au marqueur sur le fond de la boite pour repérer le premier dépôt
2. Etaler une oëse de culture au niveau du point en faisant des stries serrées toujours dans le même sens. Flamber l’oëse
3. Faire des stries serrées toujours dans le même sens en repassant dans le premier dépôt. Flamber l’oëse
4. Répéter l’opération (3) comme indiquer sur schéma. Finir par quelques stries ne recoupant pas le dépôt précédent. Flamber l’oëse.

-- Par filtration sur membrane. On filtre un échantillon d’eau et on le pose sur la gélose de la boite de Pétri.

L’incubation est le temps et la température qui vont être adoptés pour une croissance optimale de la population bactérienne voulue.
En hygiène de l’eau, trois températures sont appliquées.
22°C car elle caractérise les bactéries adaptées à la température de l’eau. Elles ne sont donc potentiellement peu ou pas d’origine fécale.
37°C car il s’agit de la température du corps humain. Les bactéries issues du tube digestif se développent très bien à cette température pour peu que le milieu de culture soit adapté. On peut ainsi présumé une pollution d’origine fécale et donc la présence de germes pathogènes.
44°C car seuls les germes pathogènes sont adaptés à cette température. Les germes autochtones ne résistent pas pendant tout le temps d’incubation.

On place les boites et les tubes dans une étuve qui va réguler et maintenir la température durant toute la période nécessaire.
Le temps d’incubation est variable d’un germe à l’autre. On a généralement des durées variant de 24h à 72h maximum. Ca ne sert à rien d’attendre plus. Toutes les bactéries viables présentes se seraient développées.

Lorsqu’on a des colonies, on peut les observer au microscope afin d’identifier leur morphologie.

A partir d’une colonie mise en suspension ou de l’échantillon s’il est fortement chargé en bactéries, on peut réaliser un état frais. On place une goutte de suspension sur une lame de microscope, on place une lamelle dessus, destinée à étaler la goutte et l’isoler de l’objectif du microscope. Comme on manipule du matériel biologique, on selle la lamelle avec de la paraffine.
A l’observation, on pourra noté la morphologie. Les bactéries rondes sont appelées des coques et les bactéries allongées des bacilles. Leur organisation est également visible : si elles sont isolées, par deux, en amas, en chaînette…
On peut voir aussi si les bactéries sont mobiles (on peut confirmer ou infirmer les résultats du milieu Mannitol-mobilité).

Ce test a base de coloration successive est destiné à mettre en évidence la perméabilité de la membrane des bactéries. On distingue les Gram+ et les Gram-. Les Gram- voient leur paroi fragilisée durant les différentes étapes de la coloration : le cytoplasme (intérieur de la cellule) ne retient pas toute la coloration. Il apparaît alors rose à l’observation microscopique. Les gram+ ont une paroi assez résistante qui conserve les colorants. Le cytoplasme est coloré en bleu-violet. Son but est de classer les bactéries en deux grands groupes en fonction de leur composition. Au cours des manipulations, les bactéries meurent. Il n’est donc pas possible d’observer les mêmes caractères qu’avec un état frais.

Ce test permet de mettre en évidence la présence d’une fonction respiratoire : la cytochrome oxydase. En présence d’une solution de chlorhydrate, elle produit une quinone (cycle benzénique oxydé) de couleur rose qui s’oxyde rapidement en un composé violet.
On dépose un disque de papier filtre imbibé de réactif sur une lame de verre. On ajoute à l’aide d’une oëse ou d’une pipette Pasteur boutonnée, une colonie bactérienne.
Si une coloration apparaît, cela signifie que le cytochrome oxydase est présent chez cette bactérie. On dit alors qu’elle est oxydase positif (oxydase +). Dans le cas contraire, on dit que la bactérie est oxydase négative (oxydase -), elle ne possède pas le caractère.

La catalase dégrade l’H₂O₂ issu du métabolisme oxydatif en eau et oxygène. Le dégagement d’oxygène se traduit par l’apparition de bulles.
On dépose une goutte d’H₂O₂ sur une lame. A l’aide d’une pipette boutonnée, on émulsionne dans cette goutte une colonie prélevée sur un milieu gélosé.
Un dégagement gazeux montre que la bactérie possède la catalase. On dit qu’elle est catalase +. Dans le cas contraire, elle est catalase -.

Lorsque l’on fait des cultures sur boite de Pétri, des colonies poussent à la surface de la gélose. Celles-ci peuvent, de par leur morphologie et leur couleur, donner une première idée du type bactérien présent.
Pour information, les colonies peuvent adopter les formes suivantes.